Mécanismes andogènes de contrôle des cellules souches du cerveau du mammifère nouveau-né et adulte

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pour l’obtention du Grade de

D

OCTEUR DE L

’U

NIVERSITÉ DE

P

OITIERS

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)

(Diplôme National - Arrêté du 7 Août 2006)

École Doctorale

: Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique

Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Présentée par :

Camille N

ICOLEAU

Mécanismes endogènes de contrôle

des cellules souches du cerveau

du mammifère nouveau-né et adulte

Directeurs de Thèse :

Dr. V

ALÉRIE

C

ORONAS

Pr. M

OHAMED

J

ABER

Thèse soutenue le 27 novembre 2008 devant le jury composé de :

M. Omar Benzakour, Professeur, Université de Poitiers . . . Président du Jury Mme. Catherine Belzung, Professeur, Université François Rabelais de Tours . . . Rapporteur M. Philippe Vernier, Directeur de Recherche, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard . . . Rapporteur Mme. Brigitte Onténiente, Directeur de Recherche, INSERM, Université Paris Descartes . . . Examinateur Mme. Valérie Coronas, Maître de Conférences, Université de Poitiers . . . Co-directeur de Thèse M. Mohamed Jaber, Professeur, Université de Poitiers . . . Co-directeur de Thèse

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Je remercie vivement le Pr. Mohamed Jaber de m’avoir accueillie dans son équipe de re-cherche et le Dr. Valérie Coronas de m’avoir confié un sujet de thèse si intéressant. Je tiens également à remercier le Pr. Michel Roger pour m’avoir soutenue pour l’obtention de mon al-location de recherche.

Je remercie les directeurs de l’UMR 6187, Guy Raymond puis Frédéric Becq pour m’avoir accueillie au sein de leur laboratoire et avoir toujours été disponibles.

Je remercie le Pr. Omar Benzakour pour ses précieux conseils et l’intérêt qu’il a toujours exprimé envers mes recherches. Je tiens également à exprimer toute ma gratitude à Valérie Co-ronas pour sa gentillesse, sa motivation, sa rigueur et ses encouragements.

J’adresse mes remerciements à toutes les personnes que j’ai côtoyées au sein de l’équipe « Phy-siopathologie de troubles neurodégénératifs et neuroadaptatifs » et avec qui j’ai beaucoup ap-pris : chercheurs, enseignant-chercheurs, doctorants et étudiants.

J’exprime mes remerciements au Pr. Catherine Belzung et au Dr. Philippe Vernier pour avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse. Je remercie tout autant, le Professeur Brigitte Onténiente et le Pr. Omar Benzakour pour avoir bien voulu faire partie de mon jury.

Mes remerciements s’adressent également au Dr. Anne Cantereau pour son précieux travail et ses conseils en imagerie confocale. Je remercie également James Habrioux pour son aide dans le traitement des photos et la construction des figures.

J’adresse mes plus sincères remerciements à Bruno Merceron pour son aide et sa disponibilité, Virginie Lardeux et Laetitia Cousin pour leur rigueur et leur patience. Sans vous, tout cela aurait été plus difficile.

Je remercie bien sûr tous les membres du laboratoire UMR 6187 et de l’EA 3808 pour les conseils et les discussions partagés.

Je remercie très vivement l’école doctorale IPBC et l’Université de Poitiers pour leur dispo-nibilité, leur écoute et pour les formations qu’ils proposent aux doctorants.

Je remercie Danielle Pacault et Catherine Adolfe pour leur soutien, leur aide et leur dispo-nibilité lors des TP de neurosciences que j’ai effectués pendant ma thèse.

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Merci à tous les plongeurs et biologistes subaquatiques du 86 pour ces incroyables explora-tions. . . L’aplysie a combien de neurones déjà ? ?

Un grand merci à ma famille pour leur soutien et leur écoute.

Evidemment, le plus grand merci s’adresse à Florian. . . pour ce petit bout de vie dans le Poitou. . . C’est promis, après nos soutenances, on troque la campagne pour la mer. . .

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Préambule IX

Avant-propos XI

Liste des abréviations XIII

1 Introduction 1

1.1 Neurogenèse et cellules souches neurales . . . 1

1.1.1 Découverte du phénomène . . . 1

1.1.2 La neurogenèse à partir des cellules souches de la SVZ : modalités et rôles physiologiques . . . 5

1.1.3 La SVZ et l’identité des cellules souches . . . 8

1.2 Mécanismes moléculaires de contrôle des cellules souches neurales adultes . . 15

1.2.1 Contrôle par les facteurs intrinsèques . . . 16

1.2.2 Contrôle par les facteurs solubles extracellulaires . . . 19

1.2.3 Contrôle par la matrice extracellulaire et les molécules de contact . . . 26

1.3 Influence du microenvironnement sur les cellules souches neurales . . . 30

1.3.1 Cellules souches et activité neurogénique dans le cerveau . . . 30

1.3.2 Transplantation et potentialités des cellules souches neurales adultes . . 31

1.3.3 Particularités cellulaires de l’environnement neurogénique . . . 32

1.3.4 Les cellules souches neurales et les atteintes cérébrales . . . 34

1.3.5 Les cellules souches et la régénération tissulaire . . . 36

1.4 Problématique . . . 39

2 Partie expérimentale 41 2.1 Culture de cellules de la zone sous-ventriculaire, traitements et caractérisation immunocytologique des cultures . . . 41

2.1.1 Culture primaire de cellules de la SVZ . . . 41

2.1.2 Caractérisation immunocytochimique . . . 42

2.1.3 Réalisation d’expérimentations sur les cultures de cellules de la SVZ . 45 2.2 Influence de facteurs diffusibles du microenvironnement sur les cellules de SVZ 46 2.2.1 Obtention de milieux conditionnés à partir d’explants de SVZ, de cortex ou de foie, prétraités ou non avec un inducteur d’apoptose . . . 46

2.2.2 Traitements des cultures de SVZ . . . 47

2.2.3 Effet sur la croissance des cultures et sur l’autorenouvellement des cellules 48 2.2.4 Mesure de la prolifération des cellules par l’incorporation de BrdU . . . 49

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2.3 Caractérisation des facteurs diffusibles influençant la prolifération ou la

diffé-renciation des cultures de cellules de la SVZ . . . 51

2.3.1 Etude de la thermostabilité . . . 51

2.3.2 Evaluation du poids moléculaire relatif des facteurs sécrétés. . . 51

2.3.3 Immunodéplétion des milieux conditionnés . . . 52

2.3.4 Recherche qualitative et quantitative des molécules candidates HGF et FGF-2 dans les milieux conditionnés . . . 53

2.3.5 Recherche du HGF dans les cultures de cellules de SVZ . . . 54

2.4 Voies de signalisation intracellulaires impliquées dans l’effet des facteurs sur les cellules de SVZ . . . 54

2.4.1 Recherche du récepteur c-Met dans les cellules de SVZ . . . 54

2.4.2 Etude de l’activation des récepteurs et des voies de signalisation . . . . 54

2.5 Détermination du rôle physiologique du HGF et des mécanismes sous-jacents in vivo . . . . 55

2.5.1 Recherche du HGF et de son récepteur c-Met dans la SVZ de souris adulte 55 2.5.2 Effets des injections intracérébroventriculaires de HGF ou d’anti-HGF chez la souris adulte . . . 56

2.6 Analyse des données et tests statistiques . . . 57

2.6.1 Photographies . . . 57

2.6.2 Mesures . . . 57

2.6.3 Analyses statistiques . . . 57

3 Etude expérimentale 1 : Effets de facteurs diffusibles issus de cortex cérébral lésé sur les cellules de la SVZ : rôle du FGF-2 59 3.1 Résultats . . . 60

3.1.1 Effet des facteurs libérés par les explants de cortex lésé sur la proliféra-tion et la différenciaproliféra-tion des cellules de la SVZ . . . 60

3.1.2 Recherche des mécanismes sous-jacents et implication du FGF-2 . . . 61

3.2 Discussion . . . 66

4 Etude expérimentale 2 : Le HGF et son rôle dans la prolifération des cellules de la SVZ au sein de la niche neurogène 69 4.1 Résultats . . . 70

4.1.1 Les facteurs issus de milieu conditionné hépatique augmentent la proli-fération des cellules de la SVZ . . . 70

4.1.2 La molécule responsable de l’effet mitogène du milieu conditionné hé-patique est le HGF . . . 72

4.1.3 Le HGF agit sur les cellules de type souches au sein de la SVZ et sti-mule leur autorenouvellement . . . 75

4.1.4 Le HGF interagit avec c-Met et active la voie des MAPkinases . . . 78

4.1.5 Les cellules de la SVZ produisent et libèrent du HGF . . . 82

4.1.6 Le HGF endogène est un mitogène majeur au sein de la niche neurogène in vivo . . . . 86

4.2 Discussion . . . 89 VI

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5.1 Résultats . . . 94 5.1.1 Influence des facteurs hépatiques sur la morphologie des cellules

consti-tuant les neurosphères obtenues à partir de cultures de cellules de SVZ . 94 5.1.2 Caractérisation des facteurs impliqués dans l’effet de différenciation

in-duit par le milieu conditionné hépatique . . . 96 5.1.3 Le HGF n’est pas impliqué dans l’effet étudié . . . 96 5.2 Discussion . . . 96 6 Conclusion et Perspectives 99 Bibliographie 105 Annexes 136 A Article1 1 B Article2 3 VII

(8)
(9)

Depuis toujours, l’homme est fasciné par la régénération et par l’éventuelle possibilité, d’un jour, devenir immortel. . . Déjà dans la mythologie grecque, de nombreux épisodes mettaient en scène la renaissance perpétuelle et la quête d’immortalité. Prométhée qui déroba le précieux pouvoir de créer à Zeus fut par vengeance enchaîné sur le mont Caucase pour y avoir chaque jour le foie dérobé par un aigle. Mais l’organe n’avait cesse de repousser. . . Le foie se régénérait. Ce mythe s’est révélé prodigieusement visionnaire puisque aujourd’hui les incroyables capacités de régénération du foie ne sont plus mythiques.

Il a longtemps été asséné que les neurones, contrairement aux cellules du foie ou de la peau, n’étaient plus générés après la naissance. Ce dogme est aujourd’hui bien controversé puisque de nombreuses études réalisées chez l’animal et chez l’Homme apportent la preuve que les neu-rones peuvent eux aussi se renouveler. En effet, au sein du cerveau de rongeurs et du cerveau humain, deux zones dans lesquelles une activité de neurogenèse perdure ont été identifiées : le gyrus denté de l’hippocampe et la zone sous-ventriculaire qui longe les ventricules latéraux. Dans ces zones bien spécifiques, de nouvelles cellules sont produites en permanence et per-mettent le renouvellement de neurones au niveau local : les cellules nouvellement générées dans le gyrus denté sont responsables du renouvellement de certains neurones de l’hippocampe et celles issues de la SVZ permettent le remplacement des interneurones du bulbe olfactif. La capacité à produire de nouveau neurones tout au long de la vie d’un individu est liée à la présence de cellules souches dans le cerveau. Découvertes très récemment dans le cerveau des mammifères adultes, les cellules souches neurales suscitent actuellement un intérêt majeur. Gardiennes du secret de la régénération, leur utilisation pourrait s’avérer essentielle dans le cadre de thérapies contre les atteintes neurodégénératives, les lésions ou encore les ischémies cérébrales. D’un point de vue éthique, l’utilisation de cellules souches neurales adultes serait plus acceptable que la manipulation de cellules souches embryonnaires nécessitant la produc-tion d’embryon humain et/ou l’utilisaproduc-tion des embryons surnuméraires issus de la fécondaproduc-tion

in vitro.

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vement des cellules souches dans le cerveau puis leur implantation après culture dans les sites lésionnels causés par la pathologie considérée ; la deuxième, moins invasive serait basée sur la mobilisation des cellules souches déjà présentes dans le cerveau puis leur acheminement vers les sites nécessitant le remplacement de neurones. Mais avant d’envisager de telles thérapies, il convient d’approfondir nos connaissances relatives à la biologie des cellules souches neurales adultes.

Mon travail de thèse s’inscrit dans l’engagement international visant à répondre aux diffé-rentes interrogations relatives au comportement des cellules souches neurales adultes présentes dans la zone sous-ventriculaire de rongeurs. J’ai mené des investigations relatives à l’influence de différents facteurs endogènes et exogènes sur la régulation des cellules souches neurales adultes au sein de la SVZ. Ainsi, en apportant des informations essentielles sur les mécanismes de régulation des cellules souches neurales adultes, mes travaux permettront d’établir des don-nées indispensables à la mise en place de thérapies cellulaires pour rétablir le fonctionnement du cerveau de l’Homme.

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La découverte de la persistance de la neurogenèse dans le cerveau de mammifères adultes a suscité de nombreux travaux de recherche en neurosciences au cours la dernière décennie. En particulier, la caractérisation des mécanismes de contrôle de la prolifération et du devenir des cellules souches neurales constitue un des objectifs majeurs des études actuelles en rai-son de l’application potentielle qu’il représente. Dans notre laboratoire ainsi que dans d’autres sites, nous recherchons depuis plusieurs années des mécanismes endogènes de régulation des cellules souches neurales et en particulier leur implication dans les processus de neurogenèse constitutive ou induite par la lésion. C’est dans ce cadre que mon projet de thèse a été réalisé.

Mon manuscrit de thèse propose dans sa première partie une revue des données bibliogra-phiques qui présente de manière successive la découverte de la neurogenèse et la biologie des cellules souches, les mécanismes de régulation des cellules souches neurales connus puis le rôle des niches germinatives et l’importance du micro-environnement dans la régulation des cellules souches neurales. En dépit des connaissances des effets des facteurs exogènes sur les cellules souches neurales, les mécanismes endogènes de contrôle des cellules souches neurales restent méconnus.

L’objectif de ma thèse a été d’étudier les mécanismes endogènes de régulation des cellules souches neurales selon deux approches différentes. La première concerne le processus de re-crutement des cellules souches neurales en réponse à une lésion cérébrale corticale. Nous avons examiné in vitro les mécanismes impliqués dans les effets du cortex cérébral lésé par apop-tose sur les cellules souches neurales. Le choix du deuxième modèle tissulaire est basé sur la conservation de nombreux mécanismes de régulation entre les cellules souches de différents tissus et sur les capacités régénératives du foie. Dans ce cadre, nous avons étudié et caractérisé l’influence des facteurs hépatiques sur les cellules de la zone sous-ventriculaire. Les résultats obtenus lors de ces investigations seront exposés et discutés en lien avec les données établies par la littérature. L’ensemble de mon travail sera mis en perspective dans la dernière partie de mon manuscrit.

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6-OHDA : 6-hydroxydopamine

A ApoE : Apolipoprotéine E

Ara-C : Cytosine-β-arabinofuranoside

B BDNF : Brain-derived neurotrophic factor

bHLH : basic helix-loop-helix BLBP : Brain lipid binding protein BMP : Bone morphogenic protein BO : Bulbe olfactif

BrdU : Bromodésoxyuridine

C CM : Conditionned medium, milieu conditionné

CNTF : Ciliary neurotrophic factor CNTFR : Récepteur du CNTF

D Dcx : Doublecortine

DG : Dentate gyrus, gyrus denté de l’hippocampe

E EGF : Epidermal growth factor

EGF-R : Récepteur de l’EGF

ELISA : Enzyme-linked sandwish immunosorbent assay EPO : Erythropoiétine

F FGF-2 ou bFGF : Fibroblast growth factor

FGFR : Récepteur du FGF

G GABA : Acide gamma-aminobutyrique

GDNF : Glial cell line-derived neurotrophic factor GFAP : Glial fibrillary acidic protein

GS : Glutamine synthétase

H HATs : Histone acetyl transferase

HB-EGF : Heparin-binging EGF-like growth factor HDACs : Histone deacetylate transferase

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IL-6 : Interleukine-6

L LCM : Liver conditionned medium

LIF : Leukaemia inhibitory factor

LIFR : Récepteur du leukaemia inhibitory factor

M MAM : Methylazoxymethanol acetate

MAP-2 : Microtubule associate protein-2 mCD24 : mouse cluster of differentiation 24 MDB1 : Methyl-CpG binding protein1 MDCK : Madin-darby canine kidney MIA : Migratory-inducing activity miRNA : micro-ARN

MPTP : 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

N Ngn : Neurogenin

NO : Monoxyde d’azote NOS : NO synthases

P PDGF : Platelet derived growth factor

PSA-NCAM : Polysialyl acid-neural cell adhesion molecule PTU : Propyl-thio Uracil

R RMS : Rostral migratory stream

S SCF : Stem cell factor

SFM : Serum free medium

SGZ : Subgranular zone, zone sous-granulaire shh : sonic hedgehog

Smo : patched 1-smoothemed SNC : Système nerveux central

SVZ : Subventricular zone, zone sous-ventriculaire

T TGFα : Transforming growth factor α

TGFβ : Transforming growth factor β TNFα : Tumor necrosis factorα

V VEGF : Vascular endothelial growth factor

VLDLR : Very low density lipoprotein receptor VZ : Ventricular zone, zone ventriculaire

W WB : Western blot

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I

NTRODUCTION

Sommaire

1.1 Neurogenèse et cellules souches neurales . . . . 1 1.2 Mécanismes moléculaires de contrôle des cellules souches neurales adultes 15 1.3 Influence du microenvironnement sur les cellules souches neurales . . . . 30 1.4 Problématique . . . . 39

1.1

Neurogenèse et cellules souches neurales

1.1.1

Découverte du phénomène

1.1.1.1 Des premières mises en évidence de la neurogenèse à la fin d’un dogme

Jusque dans les années 1960, le cerveau de mammifères adultes était considéré comme un organe incapable de se régénérer. Il était admis que le cerveau était constitué d’un stock stable de neurones et que chaque cellule perdue au cours de la vie n’était pas remplacée. L’utilisa-tion de la thymidine tritiée qui s’incorpore dans l’ADN des cellules en division avait permis à l’équipe d’Altman de montrer que de nouveaux neurones dans le cerveau de rongeur étaient gé-nérés dans le gyrus denté (DG) de l’hippocampe, site impliqué dans les processus de mémoire, et dans le bulbe olfactif, site impliqué dans le traitement des informations olfactives (Altman et Das, 1965 ; Altman, 1969). Le suivi des cellules nouvellement générées dans le bulbe olfactif suggérait qu’elles provenaient de la zone sous-ventriculaire (SVZ) située en bordure des ven-tricules latéraux. Toutefois, la caractérisation des cellules générées, basée uniquement sur leur description morphologique, a rendu ces résultats sujets à controverse (Fig. 1.1).

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Figure 1.1 – Localisation de la neurogenèse in vivo dans le cerveau de mammifères adultes. L’ajout de nouveaux neurones a lieu dans deux régions : le gyrus denté (DG) de l’hippo-campe et le bulbe olfactif (BO). Les neurones du bulbe olfactif sont générés dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) et empruntent le flux migratoire rostral (RMS) pour rejoindre le bulbe. D’après Taupin et Gage, 2002.

Ultérieurement, de nouvelles techniques de suivi des cellules en division et de leurs cellules filles, combinées à de nouvelles méthodes d’identification des cellules ont permis de confirmer l’existence de la neurogenèse dans le cerveau de mammifères adultes. La première de ces tech-niques se base sur l’incorporation de BrdU, base analogue de la thymidine dans l’ADN des cellules en division lors de la phase S du cycle cellulaire. Le BrdU peut être détecté par im-munohistochimie ce qui rend possible la caractérisation phénotypique des cellules générées par immunomarquage (Gratzner, 1982). La deuxième technique repose sur l’intégration de gènes rapporteurs au moyen de rétrovirus exclusivement dans l’ADN des cellules en division (Price et al., 1987 ; Sanes et al., 1986). Des travaux utilisant ces deux techniques ont confirmé l’existence de la neurogenèse au sein du système nerveux central de rongeurs adultes (Corotto et al., 1993 ; Seki et Arai, 1993 ; Luskin, 1993). Aussi, l’enregistrement de l’activité éléctrophysiologique des cellules nouvellement formées a apporté la preuve que les nouveaux neurones générés au sein du cerveau de mammifères adultes étaient capables de s’intégrer fonctionnellement dans les réseaux neuronaux déjà existants (Belluzzi et al., 2003 ; Carleton et al., 2003 ; van Praag et al., 2002). Cette activité neurogénique a également été démontrée dans le cerveau de primate non humain au sein du système SVZ - bulbe olfactif (Kornack et Rakic, 2001) et de l’hippo-campe (Gould et al., 1999a ; Kornack et Rakic, 1999). De manière plus intéressante encore, de nouveaux neurones ont pu être détectés dans l’hippocampe de patients âgés ayant reçu une administration de BrdU pour l’établissement d’un diagnostic concernant la progression de leur cancer. Cette découverte et la mise en évidence ultérieure de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif humain ont relancé les travaux de recherche sur la neurogenèse adulte (Eriksson et al., 1998 ; Bedart et Parent, 2004 ; Sanai et al., 2004).

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Ces travaux ont mis fin au dogme d’une restriction de la neurogenèse aux stades embryon-naires chez les mammifères et ont établi que l’ajout de nouveaux neurones perdure à l’âge adulte, de manière restreinte et localisée. Toutefois, la neurogenèse décroît avec l’âge tant au sein du bulbe olfactif (Enwere et al., 2004 ; Luo et al., 2006 ; Maslov et al., 2004 ; Tropepe et al., 1997) que dans l’hippocampe, aussi bien chez la souris que chez le marmouset (Kuhn et al., 1996 ; Leuner et al., 2007).

Chez les mammifères, la capacité de régénération d’un tissu tout au long de la vie repose sur la présence en son sein de cellules souches. L’existence de la neurogenèse a conduit à rechercher la présence de cellules souches dans le cerveau de mammifères adultes.

1.1.1.2 Découverte des cellules souches neurales

Une cellule souche est une cellule non différenciée capable de se multiplier à l’identique et de générer un répertoire plus ou moins étendu de types cellulaires suivant le stade de déve-loppement dont elle est issue. Chez les mammifères, du stade zygote jusqu’au stade morula, les cellules souches sont totipotentes c’est-à-dire capables de générer un individu entier lors-qu’elles sont placées dans l’utérus d’un individu vivant. Ensuite, les cellules souches isolées au stade blastocyste, appelées cellules ES, sont pluripotentes c’est-à-dire capables de générer tous les tissus et organes d’un organisme mais pas les tissus extra embryonnaires. Après ce stade, les capacités de différenciation des cellules souches se restreignent, les cellules souches sont alors multipotentes. De telles cellules souches sont présentes chez les mammifères adultes au sein des différents tissus. Les caractéristiques cardinales des cellules souches adultes ont été décrites à partir du modèle des cellules souches hématopoïétiques (Hall et Watt, 1989). Les cellules souches sont des cellules qui :

– s’autorenouvellent, maintenant ainsi le stock de cellules souches tout au long de la vie par divisions symétriques d’une cellule souche en deux cellules souches filles ;

– génèrent des progéniteurs capables de proliférer transitoirement et d’adopter des phéno-types cellulaires différents. La distinction entre cellule souche et progéniteur n’étant pas toujours claire, les deux types cellulaires sont quelquefois regroupés sous le terme de précurseurs.

En 1992, Reynolds et Weiss, transposant des méthodes utilisées pour d’autres tissus, ont pour la première fois isolé des cellules souches neurales dans le cerveau de souris adultes (Reynolds et Weiss, 1992). Placées en présence de deux facteurs de croissance, l’Epidermal Growth Factor (EGF) et le Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), les cellules isolées de la SVZ de rongeurs adultes prolifèrent et forment des amas appelés neurosphères. Ces neurosphères, dissociées en cellules uniques, génèrent de nouvelles neurosphères indiquant une capacité d’autorenouvel-lement des cellules souches neurales. Après induction de la différenciation, les cellules ainsi obtenues génèrent les trois principaux types de cellules constituant le système nerveux central

(18)

(SNC) à savoir les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes (Fig. 1.2). Etant capables de proliférer, s’autorenouveler et de se différencier, les cellules de la SVZ répondent aux critères de cellules souches.

Figure 1.2 – Les caractéristiques cardinales des cellules souches de la zone

sous-ventriculaire (SVZ). Elles prolifèrent, s’autorenouvellent et génèrent les 3 types cellulaires

majeurs du SNC : neurones, astrocytes et oligodendrocytes.

Chez l’humain, des cellules souches neurales ont également pu être obtenues à partir de tis-sus prélevés post-mortem sur des cerveaux adultes (Palmer et al., 2001). Ces cellules ont pu être maintenues pendant plus d’un an et cryoconservées sans altération notable de leurs propriétés (Ayuso-Sacido et al., 2008). De plus, des cellules souches neurales ont pu être dérivées à partir de biopsies collectées dans la région bordant les ventricules latéraux de patients (Sanai et al., 2004 ; Kukekov et al., 1999). Les cellules souches neurales humaines isolées produisent in vitro des neurosphères et génèrent les trois types de cellules constituant le système nerveux central (Westerlund et al., 2003). L’ensemble de ces travaux ouvre la possibilité pour le développe-ment de futures thérapies basées sur l’auto-transplantation, ce qui permettrait de contourner à la fois les problèmes éthiques liés à l’utilisation des cellules souches embryonnaires et immu-nologiques liés au rejet de greffe.

Les cellules souches neurales persistent dans la SVZ tout au long de la vie d’un animal mais leur nombre diminue avec l’âge. Il est estimé que des souris âgées de 24 mois possèdent moitié

(19)

moins de cellules souches neurales que des individus de 4 mois (Maslov et al., 2004 ; Tropepe et al., 1997). Ce phénomène est à mettre en relation avec la baisse de neurogenèse constatée chez des individus âgés.

1.1.2

La neurogenèse à partir des cellules souches de la SVZ : modalités

et rôles physiologiques

In vivo, dans la SVZ de rongeurs adultes, les cellules souches prolifèrent et génèrent des

neuroblastes et des cellules gliales (Lois et Alvarez-Buylla, 1993 ; Levison et Goldman, 1993). Les cellules gliales issues de la SVZ migrent vers la substance blanche ou dans l’hémisphère controlatéral via le corps calleux et se différencient en astrocytes et oligodendrocytes chez le rongeur adulte (Levison et al., 1993). Les neuroblastes nouvellement générés quittent la SVZ puis migrent en chaîne de manière unidirectionnelle le long du flux migratoire rostral (RMS) en direction du bulbe olfactif où ils s’intègrent en tant qu’interneurones dans les réseaux neuronaux déjà existants (Hu et Rutishauser, 1996 ; Luskin, 1993 ; Lois et al., 1996 ; Lois et Alvarez-Buylla, 1994 ; Carleton et al., 2003) (Fig. 1.3.A). Il est estimé que dans le cerveau de rongeur adulte, 30 000 cellules générées par la SVZ empruntent le RMS chaque jour pour s’intégrer dans le bulbe olfactif (Alvarez-Buylla et al., 2001). Ainsi, pour rejoindre leur cible, les neuroblastes parcourent la distance de 5 mm, ce qui requiert généralement 2 à 6 jours (Doetsch et Alvarez-Buylla, 1996 ; Hu et al., 1996 ; Lois et Alvarez-Alvarez-Buylla, 1994 ; Luskin, 1993). Chez l’Homme, bien que ce mécanisme de migration en chaîne n’ait pas pu être identifié (Sanai et al., 2004 ; Macas et al., 2006 ; Curtis et al., 2007), les neuroblastes rejoindraient le bulbe olfactif en suivant le flux du liquide céphalorachidien le long d’une structure apparentée au flux migratoire rostral et organisée autour d’une extension du ventricule latéral (Sawamoto et al., 2006).

1.1.2.1 Modalités et mécanismes de migration vers le bulbe olfactif

De nombreuses études ont été menées afin de déterminer les éléments responsables de la migration des neuroblastes vers le bulbe olfactif. In vitro, les neuroblastes s’organisent spon-tanément en chaînes et migrent selon un mode neurophilique mettant en jeu des contacts ho-motypiques à partir d’explants de SVZ (Wichterle et al., 1997 ; Lois et Alvarez-Buylla, 1994). Les chaînes des neuroblastes expriment de hauts niveaux de Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) polysialylées (PSA-NCAM). Les souris invalidées pour la NCAM ou traitées avec de l’endoneuraminidase N, une enzyme qui détache spécifiquement les groupements polysialylés (PSA), présentent un déficit de migration rostrale des précurseurs de la SVZ, déficit qui se tra-duit par une réduction de la taille du bulbe olfactif (Cremer et al., 1994 ; Hu et al., 1996). Les chaînes des neuroblastes sont entourées par des manchons formés d’astrocytes qui, via la

(20)

libé-ration de MIA (miglibé-ration-inducing activity), pourraient participer au contrôle de la miglibé-ration (Mason et al., 2001).

De manière similaire à ce qui est observé lors du développement, la migration des cellules vers le bulbe olfactif est guidée par des molécules chémoattractives et chémorépulsives. Parmi ces molécules, le morphogène sonic hedgehog (shh) contribue à la chémoattraction des neu-roblastes vers le bulbe olfactif (Angot et al., 2008). Par ailleurs, bien que l’absence de bulbe olfactif ne semble pas affecter la migration des neuroblastes le long du RMS (Jankovski et al., 1998 ; Kirschenbaum et al., 1999), le bulbe olfactif produit de la netrine et du GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) qui contribuent à diriger la migration des neuroblastes vers leur cible (Murase et Horwitz, 2002 ; Paratcha et al., 2006). Le guidage des neuroblastes vers le bulbe olfactif met également en jeu des molécules chémorépulsives dont notamment Slit1 et Slit2 libérées par le septum (Chen et al., 2001 ; Nguyen-Ba-Charvet et al., 2004 ; Wu et al., 1999) (Fig. 1.3.B) .

A

Bulbe olfactif

B

Figure 1.3 – La migration des neuroblastes vers le bulbe olfactif. (A) Migration en chaîne. Les nouveaux neurones issus de la SVZ migrent dans le RMS en formant des chaînes. Celles-ci (en rouge) sont entourées par des astrocytes (en bleu) dont certains ont des contacts avec les vaisseaux sanguins (en blanc). D’après Alvarez-Buylla et Garcia-Verdugo, 2002. (B) Régulation de la migration dans le RMS. Modifiée d’après Murase et Horwitz, 2002.

(21)

1.1.2.2 Renouvellement des neurones du bulbe olfactif

Une fois parvenus dans le bulbe olfactif, les neuroblastes se détachent des chaînes de mi-gration et migrent de manière radiale pour rejoindre les couches cellulaires constituant le bulbe olfactif. Ce changement de mode de migration des neuroblastes serait déclenché par la Reelin (Hack et al., 2002) (Fig. 1.3.B). Lorsqu’ils atteignent leur position finale dans le bulbe olfac-tif, les neuroblastes se différencient en deux types d’interneurones, des neurones granulaires gabaergiques pour 75 à 99% d’entre eux et des neurones périglomérulaires gabaergiques et/ou dopaminergiques (Belluzzi et al., 2003 ; Carleton et al., 2003 ; Luskin et al., 1998). Les neurones nouvellement générés intègrent les circuits neuronaux déjà en place et contribuent au traitement des informations olfactives (Carlen et al., 2002). Il est estimé que seule la moitié des neurones ayant atteint le bulbe survivent, permettant ainsi l’ajout d’environ 10 000 neurones granulaires et 150 neurones périglomérulaires par jour (Petreanu et Alvarez-Buylla, 2002 ; Winner et al., 2002). Par ce procédé, entre 65% et 77% des neurones du bulbe sont remplacés toutes les six semaines (Kato et al., 2001).

Il est à noter toutefois que chaque population de neurones est issue d’une région spécifique de la SVZ. Le suivi individuel, par marquage viral, de cellules issues de la SVZ a montré que se-lon leur position au sein de la SVZ, les cellules sont à l’origine de sous-populations spécifiques d’interneurones (Merkle et al., 2007). Ainsi, les cellules de la région dorsale génèrent des inter-neurones dopaminergiques et des cellules granulaires superficielles alors que celles localisées dans des positions plus ventrales donnent naissance aux interneurones granulaires profonds. La SVZ apparaît donc comme une mosaïque de cellules et non comme une structure uniforme.

1.1.2.3 Rôle physiologique de la neurogenèse

L’existence d’un renouvellement perpétuel des neurones du bulbe olfactif a suscité des tra-vaux sur les fonctions physiologiques de ce processus. De manière intéressante, la privation olfactive par obstruction nasale réduit la neurogenèse chez la souris adulte (Mandairon et al., 2006a ; Corotto et al., 1994). A l’inverse, l’exposition de souris à un environnement olfactif enrichi accroît la neurogenèse olfactive en augmentant la survie des neurones (Rochefort et al., 2002 ; Alonso et al., 2006 ; Woo et al., 2006). Il a été montré que cette augmentation de neu-rogenèse s’accompagne d’une amélioration de la mémoire olfactive (Rochefort et al., 2002). Ceci suggère une relation entre la neurogenèse et l’activité neuronale, qui sous-tendrait des phénomènes de plasticité accompagnant les processus de mémoire et d’apprentissage.

De plus, durant la gestation et pendant quelques jours après la mise bas, la prolifération des cellules de la SVZ et la neurogenèse bulbaire sont augmentées. Les neurones alors ajoutés au réseau neuronal bulbaire chez la mère pourraient contribuer à la reconnaissance olfactive de sa progéniture (Shingo et al., 2003). Il est intéressant de noter à cet égard que des souris déficientes

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en molécules d’adhérence cellulaire NCAM présentent un déficit de migration des neuroblastes le long du RMS ce qui conduit à une réduction notoire de la taille des bulbes olfactifs liée à un manque de cellules granulaires. L’analyse des fonctions olfactives chez ces animaux a révélé que ces souris ont des difficultés à discriminer les odeurs suggèrant un rôle de la neurogenèse adulte dans la discrimination des odeurs (Gheusi et al., 2000).

Le lien entre neurogenèse et activité physiologique a également pu être établi pour l’hip-pocampe. Chez les rongeurs adultes, 9 000 cellules sont générées chaque jour permettant le renouvellement de 6% de la population des neurones granulaires de l’hippocampe en un mois (Cameron et McKay, 2001). L’élevage de souris en environnement enrichi et l’accès libre à une roue motrice augmentent la neurogenèse dans le DG de l’hippocampe (Brown et al., 2003 ; Kempermann et al., 1997 et 1999 ; van Praag et al., 1999) et augmentent les performances mné-siques (Bruel-Jungerman et al., 2005). Ceci indiquerait une relation entre mémoire et neuroge-nèse. Afin d’établir la relation causale entre ces deux processus, la neurogenèse a été bloquée par l’administration pendant 14 jours d’un traitement antimitotique à l’acétate de méthylazoxymé-thanol (MAM) ou par l’ablation sélective des progéniteurs du DG au moyen d’une irradiation. Ces traitements conduisent tous deux à une diminution importante de la capacité à l’apprentis-sage lors d’exercices de conditionnement ou de tâches de mémorisation spatiale (Dupret et al., 2008 ; Shors et al., 2001).

1.1.3

La SVZ et l’identité des cellules souches

La zone sous-ventriculaire contient la grande majorité des cellules en prolifération dans le cerveau de mammifères adultes dont les rongeurs (Altman, 1963 ; Lois et Alvarez-Buylla, 1993 ; Morshead et al., 1994), les primates non humains (Gould et al.,1998 ; 1999a et 2001) et les humains (Bernier et al., 2000 ; Eriksson et al., 1998). En raison de leur intérêt potentiel pour le traitement des maladies neurodégénératives, les cellules souches de la SVZ ont fait l’objet d’une attention particulière ces dernières années. Il est primordial aujourd’hui, tant sur le plan fondamental que pour une éventuelle utilisation thérapeutique, de pouvoir les identifier et de comprendre leur dynamique.

1.1.3.1 Organisation de la SVZ des rongeurs

Chez les rongeurs, la SVZ est constituée de différents types cellulaires identifiés par leurs caractéristiques morphologiques et phénotypiques (Doetsch et al., 1997 et 1999a). Séparées de la cavité ventriculaire par une couche de cellules épendymaires ciliées exprimant la glycopro-téine mcD24 (Calaora et al., 1996), les cellules constituant la SVZ sont de trois types (Fig. 1.4 et Tab. 1.1) :

(23)

– Les cellules de type A expriment la βIII-tubuline, une protéine du cytosquelette présente dans les neurones (Memberg et Hall, 1995 ; Menezes et Luskin, 1994) et les protéines membranaires PSA-NCAM et mcD24 (Kiss et Rougon, 1997 ; Seki et Arai, 1993). Ce sont des neuroblastes qui continuent à se multiplier (Menezes et al., 1995) tout en migrant vers le bulbe olfactif (Lois et al., 1996 ; Wichterle et al., 1997 ; Doetsch et Alvarez-Buylla, 1996).

– Les cellules de type B expriment la GFAP (glial fibrillary acidic protein), protéine spé-cifique des cellules gliales, et la nestine, protéine des filaments intermédiaires présente dans les cellules immatures (Frederiksen et McKay, 1988 ; Lendahl et al., 1990). Ce sont des astrocytes ayant un faible taux de prolifération (Morshead et al., 1994 et 1998). – Les cellules de type C expriment la nestine et prolifèrent rapidement ; ce sont des

précur-seurs immatures. Les cellules de type C forment des amas et sont associés aux chaînes de neuroblastes. Ces deux types cellulaires sont contenus dans des manchons cellulaires constitués d’astrocytes de type B qui se prolongent vers l’avant pour délimiter le flux rostral migratoire (Peretto et al., 1997).

Figure 1.4 – Organisation de la zone sous-ventriculaire de mammifère adulte. Schéma d’une coupe frontale de cerveau faisant apparaître la SVZ adjacente aux ventricules latéraux (LV) et les différents types cellulaires. A : neuroblastes ; B : astrocytes ; C : cellules progénitrices ; E : cellules épendymaires. D’après Alvarez-Buylla et al., 2002

1.1.3.2 Une identité gliale des cellules souches de la SVZ

L’identification des cellules souches au sein de la SVZ a reposé sur l’utilisation de méthodes de marquage permettant le suivi cellulaire ou sur l’ablation de catégories cellulaires spécifiques dans des conditions basales ou au cours de la régénération.

Les cellules de type B comme cellules souches

(24)

ac-tivées. Cette propriété a été mise à profit pour obtenir des informations sur l’identité des cellules qui, au sein de la SVZ, constituent les cellules souches. Pour cela, la SVZ a été endommagée par infusion pendant 6 jours d’un agent antimitotique, le cytosine-β-D-arabinofuranoside (Ara-C) dans le cerveau de souris adulte (Doetsch et al., 1999a). Ce traitement provoque la mort des cellules à prolifération rapide, les cellules de type A et de type C, mais épargne les cellules épendymaires (type E) et les astrocytes (type B). Après l’arrêt du traitement, la SVZ se recons-titue en 2 semaines (Fig. 1.5.A). Dans ce modèle, les cellules de type B se divisent, puis au bout de 2 jours apparaissent de manière séquentielle les cellules de type C puis A. Ceci suggére que les cellules B sont les cellules souches neurales, capables de régénérer la SVZ (Fig. 1.5.B).

Figure 1.5 – Identité de la cellule souche de la SVZ. (A) Illustration de la régénération des cellules de la SVZ de souris adulte après traitement à l’Ara-C. De gauche à droite : les divers types cellulaires composant la SVZ ; les cellules en prolifération rapide C et A sont éliminées par l’Ara-C, les astrocytes (ou cellules de type B) survivent et certains contactent le ventricule latéral (indiqué par les flèches) ; après 2 jours, des progéniteurs (ou cellules de type C) appa-raissent ; après 14 jours, des neuroblastes (ou cellules de type A) sont régénérés (Doetsch et al., 1999a). (B) Schéma de la régénération des cellules de la SVZ. Modifiée d’après Doetsch et al., 1999b.

L’identité astrocytaire de la cellule souche a été confirmée par un marquage génique des astrocytes et de leur descendance. Pour cela, le virus de la leucose aviaire contenant la Phos-phatase Alkaline a été injecté dans les ventricules cérébraux de souris transgéniques exprimant le récepteur au virus de leucose aviaire sous le contrôle du promoteur GFAP. Ainsi, seules les cellules exprimant GFAP qui, dans ces souris transgéniques, portent à leur surface le récepteur du virus sont infectées. Le gène rapporteur a été retrouvé dans les cellules GFAP de la SVZ 3 jours après l’infection. Par la suite, ont été identifiés dans le RMS, des neuroblastes exprimant le gène rapporteur et dans le bulbe olfactif, de nombreux neurones marqués respectivement au

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Antigène exprimé Cellule de type A Neuroblaste Cellule de type B Astrocyte Cellule de type C Progéniteur Cellule de type D Tanycyte Cellule de type E Cellule épendymaire PSA-NCAM + - - - -βIII-tubuline + - - - -GFAP - + - + + Nestine + + + n.d. + Dlx-2 + - + - -EGF-R - + + n.d. n.d. mCD24 + - - + + LeX/SSEA1 - + + -

-Tableau 1.1 – Expression de différents marqueurs cellulaires dans la SVZ de la

sou-ris adulte. PSA-NCAM : forme polysialysée de la Neural Cell Adhesion Molecule ; βIII-tubuline : protéine du cytosquelette des neurones ; GFAP (glial fibrillary acidic protein) :

pro-téine du cytosquelette des astrocytes ; Nestine : propro-téine du cytosquelette des cellules imma-tures ; Dlx-2 : facteur de transcription ; EGF-R : récepteur de l’EGF ; mCD24 : mouse cluster of differentiation-24 ; LeX/SSEA1 : glucide exprimé à la surface cellulaire. + : antigène ex-primé, - : antigène non exex-primé, n.d. : non déterminé. A partir de Doetsch et al., 1997 et 2002 ; Belvindrah et al., 2002 ; Capela et Temple, 2002.

bout de 4 et 14 jours suivant l’injection (Doetsch et al., 1999b). Ces travaux indiquaient que les neuroblastes qui intègrent le bulbe olfactif sont issus des cellules exprimant GFAP dans la SVZ. Afin de confirmer ces résultats, des expériences inverses d’ablation sélective des cellules exprimant la GFAP ont été réalisées. Pour cela, ont été utilisées des souris transgéniques dont les cellules GFAP produisent la thymidine kinase du virus herpès, enzyme qui métabolise le ganciclovir en métabolite toxique. Lorsqu’elles sont placées en présence de ganciclovir, seules les cellules exprimant la thymidine kinase du virus herpès produisent ce métabolite toxique et meurent. Ainsi, dans ce modèle, l’ajout de ganciclovir permet d’éliminer sélectivement les cel-lules exprimant la GFAP. Ce traitement provoque la disparition de neurosphères multipotentes dans les cultures (Imura et al., 2003), démontrant que les cellules neurales adultes capables de générer des neurosphères in vitro expriment la GFAP. De même, l’administration in vivo de gan-ciclovir à ces souris transgéniques réduit fortement le nombre de sphères obtenues en culture à partir de cellules de SVZ (Morshead et al., 2003) et diminue le nombre de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif (Garcia et al., 2004). Ce faisceau d’arguments converge vers une identité gliale des cellules souches neurales de la SVZ.

Dans la SVZ, si les astrocytes représentent 20% des cellules (Doetsch et al., 1997), les cellules souches ne représentent que 0,2 à 0,4% de la population cellulaire de la SVZ (Mor-shead et al., 1998) suggérant que les cellules souches neurales constituent une sous-population d’astrocytes. Ces astrocytes souches de la SVZ étendent un cil dans la région épendymaire, leur

(26)

permettant de contacter la cavité ventriculaire (Doetsch et al., 1997). Ils expriment le récepteur à l’EGF dont l’activation est connue pour induire une prolifération des cellules souches neurales. D’ailleurs, l’injection intracérébroventriculaire d’EGF triple le nombre des astrocytes ciliés en contact avec le ventricule (Doetsch et al., 2002 ; Kuhn et al., 1997) suggérant que la cellule souche de la SVZ est un astrocyte cilié. Outre la GFAP, cet astrocyte cilié exprime d’autres mo-lécules dont la nestine et le trisaccharide LeX/SSEA1. Toutefois, ces marqueurs sont partagés avec d’autres cellules de la SVZ, notamment les cellules de type C (Capela et Temple, 2002), ce qui rend difficile l’identification ou l’isolement des cellules souches neurales.

Une identité astrocytaire des cellules souches a aussi été démontrée dans l’hippocampe de rongeurs adultes. Des travaux analogues ont montré que l’activité de neurogenèse est liée à la présence de cellules souches et de cellules progénitrices exprimant la GFAP dans la zone sous-granulaire (SGZ) du DG (Gage et al., 1998 ; Palmer et al., 1997 ; Seri et al., 2001, Garcia et al., 2004). Les cellules alors nouvellement générées dans cette zone se différencient en neurones granulaires qui s’intègrent dans la couche de cellules granulaires de l’hippocampe (Doetsch, 2003 ; Cameron et al., 1993 ; Seri et al., 2001 ; Stanfield et Trice, 1988) (Fig. 1.6).

Figure 1.6 – Organisation de la zone sous-granulaire de mammifère adulte. Schéma d’une coupe frontale de cerveau faisant apparaître le gyrus denté (DG) de l’hippocampe et les dif-férents types cellulaires : B : astrocytes ; D : cellules progénitrices ; G : neurones granulaires. D’après Alvarez-Buylla et al., 2002.

Les cellules épendymaires comme cellules souches

Bien que, sur la base des résultats exposés ci-dessus, il est actuellement admis que les cellules B sont les cellules souches, de récents travaux ont proposé la possible existence au sein de la SVZ d’une deuxième population de cellules souches, constituée par les cellules épendymaires. Dès 1999, Johansson et ses collaborateurs avaient observé que le marquage des cellules épen-dymaires avec du DiI aboutissait à l’obtention de neuroblastes colorés dans le RMS puis de neurones marqués dans le bulbe olfactif (Johansson et al., 1999a). Ces résultats ont été très controversés et, dans leurs expériences, Doetsch et ses collaborateurs montrent que les cellules

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épendymaires ne prolifèrent pas et ne peuvent donc pas être considérées comme les précurseurs des neurones générés dans la SVZ (Doetsch et al., 1999a). De plus, les études menées in vitro montrent que les cellules épendymaires sont incapables de générer des sphères, de s’autore-nouveler et de produire des neurones (Chiasson et al., 1999 ; Doetsch et al., 1999b) et que, par ailleurs, les cellules épendymaires n’expriment pas LeX/SSEA1, molécule pourtant exprimée par les cellules souches (Capela et Temple, 2002).

Toutefois, des études récentes menées chez la souris adulte identifient une population de cel-lules épendymaires exprimant un marqueur de cellule souche, CD 133, comme étant capable de proliférer, s’autorenouveler et de générer in vivo des neurones à destination du bulbe olfactif (Coskun et al., 2008). Par ailleurs, ces cellules se sont avérées capables de régénérer la SVZ après lésion (Coskun et al., 2008).

Bien que ces travaux méritent d’être étayés par des études complémentaires, ils soulèvent l’inté-ressante possibilité que la SVZ, tout comme l’épithélium olfactif, contiendrait deux populations de cellules souches qui pourraient potentiellement être recrutées de manière différente selon les situations physiologiques ou pathologiques.

1.1.3.3 Lignage des cellules souches neurales : des cellules neuroépithéliales aux « astro-cytes souches » de la SVZ

L’identité gliale des cellules souches neurales a soulevé la question de son lien ontogé-nétique avec les cellules neuroépithéliales qui, pendant le développement, constituent les pre-mières cellules souches neurales.

La cellule neuroépithéliale

Pendant le développement, la mise en place des différentes structures cérébrales antérieures s’effectue à partir de la monocouche de cellules souches du neuroépithélium bordant le tube neural. Chez les mammifères, dans la zone ventriculaire (VZ) de l’embryon, les cellules souches neuroépithéliales émettent un cil qui entre dans le ventricule et étendent un prolongement vers la zone marginale jusqu’à la surface piale (Fig. 1.7). Pendant la phase de réplication de l’ADN, le noyau se déplace vers la zone marginale retournant ensuite dans la VZ. Différents types de division ont été décrits pour ces cellules : des divisions symétriques permettant de générer soit des cellules neuroépithéliales qui réintègrent le cycle de division soit des neurones immatures qui ne réintègrent pas le cycle de division et des divisions asymétriques où une seule cellule fille réintègre le cycle de division (Noctor et al., 2004). Les cellules neuroépithéliales, au cours du développement disparaissent et sont remplacées par des cellules bipolaires allongées, les cellules de la glie radiaire.

La glie radiaire

Les cellules de la glie radiaire ont leur soma situé dans la VZ. Elles possèdent un cil qui est en contact avec le liquide céphalorachidien et un long prolongement leur permettant de garder

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un contact étroit avec la surface piale (Gadisseux et al., 1989) (Fig. 1.7). Les cellules de la glie radiaire tout comme les cellules neuroépithéliales expriment la nestine (Hockfield et McKay, 1985) et la vimentine (Pixley et De Vellis, 1984) et présentent des épitopes spécifiques dans leur cytosquelette notamment les antigènes RC2 ou 3CB2 chez la souris et le rat respectivement (Misson et al., 1988a ; Prada et al., 1995). Les cellules de la glie radiaire se multiplient (Mis-son et al., 1988b) produisant in vivo pendant le développement, des neuroblastes. Ces derniers migrent alors vers le cortex, le long du prolongement des cellules qui leur ont donné naissance (Rakic, 1972 ; Miyata et al., 2001 ; Noctor et al., 2001 ; Tamamaki et al., 2001). Ces résultats démontrent que les cellules de la glie radiaire, contrairement aux premières théories qui consis-taient à les considérer uniquement comme gliogènes, génèrent également des neurones et de ce fait peuvent être considérées comme des cellules souches neurales. Les cellules de la glie radiaire des mammifères disparaissent quelques jours après la naissance pour devenir des astro-cytes et des cellules épendymaires (Culican et al., 1990 ; Spassky et al., 2005 ; Voigt, 1989).

Figure 1.7 – Les cellules souches appartiendraient au lignage cellule du neuroépithélium

→ glie radiaire → astrocyte. Pendant le développement, les cellules du neuroépithélium se

divisent et sont à l’origine des cellules de la glie radiaire (en bleu). Les cellules de la glie radiaire génèrent des neurones (en rouge) et leur servent de support pour la migration. A la fin du développement cortical, les cellules de la glie radiaire se différencient en astrocytes. Les cellules souches de la zone ventriculaire (SVZ) et les précurseurs de la zone sous-granulaire (SGZ) sont des astrocytes (en bleu) dans le cerveau adulte. Ils génèrent des neurones (en rouge) et des progéniteurs (en vert). Modifiée d’après Doetsch, 2003.

Les astrocytes de la SVZ appartiennent au lignage glie radiaire

Tout comme les cellules neuroépithéliales et les cellules de la glie radiaire, les cellules souches neurales de la SVZ gardent un contact avec le ventricule via un cil (Doetsch et al., 1997 ; Tra-montin et al., 2003) (Fig. 1.7). Compte tenu des séquences d’apparition et de disparition des

(29)

divers types cellulaires, il avait été proposé que les cellules gliales radiaires étaient à l’origine des astrocytes souches.

Le continuum entre les cellules souches neurales embryonnaires et les cellules souches neurales adultes a pu être démontré in vivo après marquage génique des cellules gliales radiaires chez des souris nouveaux-nés. Dans cette expérience, les cellules de la glie radiaire sont marquées par injection d’adénovirus. Quelques jours après l’injection, le gène rapporteur est identifié dans des neurones, des oligodendrocytes et des astrocytes dont ceux de la SVZ. Quelques mois après, des cellules marquées continuent de migrer vers le bulbe olfactif via le RMS. Ceci sug-gère que les cellules de la glie radiaire donnent naissance aux astrocytes souches de la SVZ qui continuent de produire des neurones et de contribuer à la neurogenèse olfactive (Merkle et al., 2004). Ces travaux suggèrent que les cellules astrocytaires souches de la SVZ appartiennent au lignage cellules neuroépithéliales → cellules de la glie radiaire → astrocytes de la SVZ adulte (Alvarez-Buylla et al., 2001 ; Bonfanti et Peretto, 2007).

Bien que l’ensemble des données de la littérature établit l’existence des cellules souches neurales et de la neurogenèse dans le cerveau de mammifères adultes, l’identité des cellules souches reste à établir. De plus, les données bibliographiques montrent qu’il existe un conti-nuum entre les cellules souches du tissu nerveux au cours du développement. Ces cellules souches neurales auraient des potentialités différentes qu’il reste à déterminer. Il est néces-saire aussi de déterminer les mécanismes qui contribuent à la progression des cellules souches neurales au sein du lignage cellules neuroépithéliales → cellules de la glie radiaire → cellules souches neurales adultes.

1.2

Mécanismes moléculaires de contrôle des cellules souches

neurales adultes

Si pendant le développement les cellules souches neurales et leurs niches sont nombreuses et éphémères, chez l’adulte celles-ci sont restreintes à deux zones, la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe. Ces régions présentent des caractéristiques particulières per-mettant le maintien de niches germinatives au sein du cerveau. Dans ces niches, l’activité et le devenir des cellules souches neurales dépendent de programmes intrinsèques dont l’expression est contrôlée par des facteurs extracellulaires solubles ou membranaires (Fig. 1.8).

(30)

Sox2 Hes1 Hes5 ... miR-9 mi-R124 miR-128...

Mash1, Ngn2, Pax6, Olig2... Acétylation des

histones

(HATs, DHATs, Bmi-1) Méthylation de l’ADN

apprentissage, mémoire stress, dépression atteintes cérébrales...

facteurs de croissance, cytokines neurotransmetteurs

hormones...

Figure 1.8 – Schéma illustrant les connexions entre différentes voies de régulation des

cel-lules souches neurales. Ensemble, les facteurs de croissance (en bleu), les régulateurs de l’état

chromatinien (en vert) et leur gènes cibles (en orange) constituent un réseau de mécanismes de régulation. Modifiée d’après Jaenish et Young, 2008.

1.2.1

Contrôle par les facteurs intrinsèques

De manière analogue à ce qui est observé au cours du développement, la prolifération, l’au-torenouvellement et le lignage cellulaire sont contrôlés par des programmes génétiques, dont l’activité dépend de régulateurs transcriptionnels, de l’état chromatinien et des micro-ARN.

1.2.1.1 Régulateurs transcriptionnels

Les régulateurs transcriptionnels contrôlent l’expression de gènes impliqués dans la dyna-mique des cellules souches neurales au sein des zones germinales. Ils contrôlent l’aiguillage entre le maintien de l’état souche et l’engagement vers un lignage spécifique.

Contrôle du maintien de l’état indifférencié des cellules souches neurales par les facteurs de transcription Sox ou Hes

Impliqués dans le maintien de l’état souche des cellules ES et utilisés pour générer des cellules pluripotentes induites (Jaenisch et Young, 2008), les facteurs de transcription Sox participent au

(31)

maintien de l’état souche des cellules souches neurales de mammifères adultes. En effet, chez le rongeur adulte, Sox2 est exprimé dans certaines régions du cerveau dont la SVZ (Ellis et al., 2004). L’invalidation du gène codant pour Sox2 chez des souris adultes provoque une réduc-tion de la neurogenèse dans la SVZ (Ferri et al., 2004). De manière intéressante, l’appariréduc-tion de capacités d’autorenouvellement chez des précurseurs d’oligodendrocytes isolés à partir du nerf optique de rat âgé de 6 jours s’accompagne d’une réactivation du gène sox2 (Kondo et Raff, 2004). Ainsi, l’expression de sox2 serait impliquée dans le maintien des caractéristiques indifférenciées des cellules souches neurales et de leur capacité à s’autorenouveler.

D’autres gènes contribuent au maintien à l’état souche des cellules, c’est le cas des gènes hes appartenant à la superclasse des gènes basic helix-loop-helix (bHLH) constitués de deux hélices α et d’une boucle contenant le domaine de liaison à l’ADN. Pendant le développement, Hes1, Hes2 et Hes5 sont exprimés par les cellules souches neurales de la zone ventriculaire (Akazawa et al., 1992 ; Allen et Lobe, 1999). La surexpression de hes1 et hes5 maintient les cellules souches neurales à l’état quiescent et bloque leur différenciation neuronale (Ishibashi et al., 1994 ; Ohtsuka et al., 2001). A l’inverse, les cellules progénitrices de souris dont les gènes codant pour hes1 et hes5 ont été invalidés se différencient précocement en neurones (Ishibashi et al., 1995) et présentent un déficit dans la capacité à générer des sphères in vitro (Ohtsuka et al., 1999). Ces résultats suggèrent donc que les gènes hes1 et hes5 seraient impliqués dans la quiescence des cellules souches neurales.

Modulation de la différenciation des précurseurs par les gènes Mash1, Neurogenine ou Pax6

Les cellules souches neurales prolifèrent et génèrent des progéniteurs dont certains s’engagent dans le lignage neuronal. La transition entre prolifération et différenciation implique l’expres-sion de gènes dits « pro-neuraux ». Deux grandes familles de régulateurs transcriptionnels contrô-lent la différenciation neurale : il s’agit des gènes bHLH Mash1, Neurogenine (Ngn) et des fac-teurs à Homeobox Pax6 et Olig2. L’analyse des fonctions de ces divers facfac-teurs a montré que Mash1 et Ngn2 orientent la différenciation des précurseurs en neurones gabaergiques et gluta-matergiques respectivement (Fode et al., 2000 ; Parras et al., 2002). Quant à Pax6, il augmente la genèse de précurseurs neuronaux dans la SVZ et oriente leur différenciation en neurones do-paminergiques périglomérulaires du bulbe olfactif (Hack et al., 2005 ; Kohwi et al., 2005). A l’inverse, Olig2 réduirait le nombre de précurseurs neuronaux et favoriserait la différenciation vers un lignage oligodendrocytaire (Hack et al., 2005).

1.2.1.2 Modifications épigénétiques

Les mécanismes épigénétiques sont des modifications transmissibles et réversibles de l’ex-pression des gènes sans qu’il n’y ait de modification de la séquence nucléotidique de l’ADN. Les modifications épigénétiques incluent la méthylation de l’ADN, la modification des histones

(32)

par acétylation ou méthylation ou encore la régulation par les micro-ARN. Tout comme dans les autres tissus de l’organisme, ces mécanismes épigénétiques contribuent à la régulation de la dynamique des cellules souches dans le cerveau des mammifères adultes.

Etat chromatinien

La chromatine est structurée autour des histones et son degré de compaction conditionne l’ac-cessibilité de l’ADN aux complexes transcriptionnels. L’état chromatinien peut être modifié via des modifications de l’ADN (méthylation) ou des protéines associées à l’ADN dont les histones. Les histones peuvent être acétylées par les enzymes Histone Acetyl Transferases (HATs). Cette modification post-traductionnelle conduit à une baisse de l’affinité des histones pour l’ADN, ce qui facilite l’accès de la machinerie de transcription à la chromatine. L’acétylation des his-tones peut être reversée par les Histone Deacetylate transferases (HDACs), qui en désacétylant les histones favorisent l’interaction entre l’ADN et les histones. Ce mécanisme provoque la condensation de la chromatine et inhibe ainsi la transcription. Ce mécanisme est impliqué dans le contrôle de la neurogenèse chez l’adulte, en particulier de la différenciation des cellules pro-génitrices de la SVZ ou de l’hippocampe en neurones (Siebzehnrubl et al., 2007 ; Hsieh et al., 2004).

La modification des histones est contrôlée par les protéines de la famille polycomb. Parmi ces protéines, Bmi-1 est un régulateur de prolifération de cellules souches dans divers tissus. L’ana-lyse des cellules de SVZ isolées chez des souris invalidées pour le gène codant Bmi-1

(bmi-1−/−) a révélé que Bmi-1 contrôle les capacités de prolifération et d’autorenouvellement des

cellules souches neurales (Molofsky et al., 2003). L’étude des mécanismes moléculaires im-pliqués a montré que l’action de Bmi-1 sur les cellules souches de la SVZ s’effectuerait via la modulation de l’activité des inhibiteurs des kinases du cycle cellulaire p16Ink4A et P19Arf (Molofsky et al., 2003).

Plus stable que la réaction d’acétylation, la méthylation de l’ADN pourrait être impliquée dans le maintien à long terme des modifications épigénétiques. La méthylation de l’ADN in-tervient essentiellement au niveau des promoteurs et est catalysée par des enzymes méthyl-transferases ou déméthylases. L’ADN méthylé est reconnu par des molécules particulières, les Methyl-CpG binding protein impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Les cel-lules souches neurales issues de souris déficientes en MBD1 (Methyl-CpG binding protein 1) présentent une diminution de leur capacité à se différencier en neurones in vivo et in vitro (Zhao et al., 2003b).

Régulation par les micro-ARN (miRNA)

Les miRNA sont des ARN non codants qui régulent l’expression des gènes en modulant la quantité d’ARNm disponible pour la traduction. Ce mécanisme contribue à la détermination de l’identité et du devenir cellulaires. Dans le cerveau adulte, certains miRNA dont miR-124, miR-128 et miR-9 sont exprimés au sein de la SVZ et de l’hippocampe. Le suivi de l’expression

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de ces miRNA et l’induction ou la suppression de leur expression par transfection a permis d’établir une implication de miR-124 et miR-9 dans la différenciation neuronale (Silber et al., 2008 ; Smirnova et al., 2005).

Ces données illustrent le rôle fondamental des processus épigénétiques dans le contrôle de la neurogenèse. La compréhension des mécanismes capables de recruter les systèmes de modifi-cations de l’état chromatinien ou d’induire ou réprimer l’expression des micro-ARN représente un enjeu majeur pour les recherches futures.

1.2.2

Contrôle par les facteurs solubles extracellulaires

1.2.2.1 Régulation par les facteurs de croissance

L’activité des cellules souches neurales est régulée par des facteurs de croissance. Parmi ces facteurs, l’EGF (Epidermal Growth Factor) et le FGF-2 (Fibroblast Growth Factor, bFGF) ont été les premiers identifiés pour leur capacité à contrôler la dynamique cellulaire des cellules souches neurales de la SVZ (Weiss et al., 1996 ; Reynolds et Weiss, 1992).

EGF

Dans la SVZ, le récepteur de l’EGF est exprimé par les cellules de type B et C (Doetsch et al., 2002 ; Seroogy et al., 1995). Ce récepteur est activé par la liaison de l’EGF mais également du HB-EGF (Heparin-binging EGF-like growth factor), du TGFα (Transforming Growth Factor

α) et de l’amphireguline. Ajouté dans des cultures, l’EGF stimule la prolifération des cellules

de la SVZ (Gritti et al., 1995 ; Reynolds et Weiss, 1992) et son administration in vivo par in-jection intracérébroventriculaire augmente la prolifération des cellules de la SVZ chez la souris adulte (Doetsch et al., 2002 ; Craig et al., 1996 ; Jin et al., 2003a ; Kuhn et al., 1997). De ma-nière intéressante, plusieurs études permettent de mettre en exergue le rôle endogène de l’EGF et du TGFα sur le maintien en condition basale des cellules souches de la SVZ. Le TGFα est abondamment sécrété dans le liquide céphalorachidien par les plexus choroïdes (Seroogy et al., 1993). Sa perte chez des souris invalidées pour le gène codant pour cette protéine (tgfα−/−)

diminue le nombre de progéniteurs ainsi que la prolifération des cellules au sein de la SVZ (Tropepe et al., 1997), suggérant un rôle du TGFα endogène dans le maintien de la neuroge-nèse adulte.

Aussi, le TGFα et l’EGF pourraient être impliqués dans le maintien et/ou le contrôle des cel-lules souches neurales dans la SVZ. Ceci parait d’autant plus intéressant qu’une diminution de l’expression du TGFα et des récepteurs à l’EGF est observée dans la SVZ lors du vieillissement (Enwere et al., 2004 ; Jin et al., 2003a), période qui s’accompagne d’une baisse de la neuroge-nèse. Ce déficit de neurogenèse peut être compensé par l’administration d’EGF exogène à des souris âgées (Jin et al., 2003a).

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FGF-2

Les cellules de la SVZ expriment le récepteur tyrosine kinase FGFR1 du FGF-2 (Gritti et al., 1999). L’activation de ce récepteur via l’apport de FGF-2 exerce des effets mitogènes dans les cultures de cellules de SVZ (Gritti et al., 1995). In vivo, l’administration de FGF-2 par injection intracérébroventriculaire ou sous-cutanée augmente la prolifération des cellules au sein de la SVZ et la neurogenèse dans le bulbe olfactif (Jin et al., 2003a ; Kuhn et al., 1997). A l’inverse, l’invalidation du gène codant pour FGF-2 conduit à une réduction de moitié du nombre de progéniteurs en division au sein de la SVZ et une diminution du nombre de neurones qui s’intègrent dans le bulbe olfactif (Zheng et al., 2004).

VEGF

Le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) est une protéine angiogénique. Au cours des dernières années, des propriétés neurotrophiques du VEGF ont été découvertes. Le VEGF ainsi que ses récepteurs ont été mis en évidence dans la SVZ (Maurer et al., 2003). L’administration intracérébroventriculaire de VEGF à des rats adultes stimule la prolifération des cellules au sein de la SVZ et du DG (Jin et al., 2002a). Le VEGF étant induit par plusieurs classes d’antidé-presseurs, son activité mitogène pourrait être l’un des mécanismes par lesquels ces traitements agissent sur la neurogenèse (Warner-Schmidt et Duman, 2007).

IGF-I

Impliqué dans la neurogenèse embryonnaire, l’Insulin-like Growth Factor (IGF-1) est exprimé dans la SVZ de souris adulte (Bartlett et al., 1992). Appliqué in vitro sur des cellules de la SVZ isolées chez des souris adultes, il augmente la différenciation neuronale observée après retrait du FGF-2. Par ailleurs, l’utilisation d’anticorps neutralisant l’IGF-1 supprime la différenciation neuronale des cellules maintenues en condition basale, c’est-à-dire en l’absence de traitement. Ceci suggère que l’IGF-1 constitue un mécanisme endogène de régulation de l’étape de diffé-renciation neuronale des cellules de SVZ (Brooker et al., 2000).

PDGF

Le Platelet Derived Growth Factor (PDGF) est un facteur de croissance qui stimule la forma-tion de plaquettes. Il exerce ses effets via des récepteurs à activité tyrosine kinase PDGFRα et PDGFRβ, tous deux exprimés par une partie des astrocytes de la SVZ (Jackson et al., 2006), les cellules immatures n’exprimant que PDGRβ (Ishii et al., 2008). L’injection de PDGF dans les ventricules cérébraux augmente le nombre d’astrocytes au sein de la SVZ et favorise la différenciation oligodendrocytaire dans les bulbes olfactifs. A l’inverse, la suppression de l’ex-pression du récepteur du PDGFα réduit le nombre d’oligodendrocytes dans les bulbes olfactifs sans toutefois affecter la neurogenèse (Jackson et al., 2006). Le récepteur PDGRβ quant à lui, serait impliqué dans des processus de survie cellulaire (Ishii et al., 2008). Ceci suggère que le PDGF joue un rôle versatile, à la fois dans le maintien de la population de progéniteurs et dans

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l’induction de différenciation, qui pourrait impliquer une convergence des signaux entre les 2 types de récepteurs.

BDNF

Le Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) est un facteur neurotrophique exprimé dans le cerveau qui exerce ses effets via les récepteurs trkB ou p75, exprimés par les cellules dans la SVZ (Young et al., 2007). L’administration in vivo de BDNF ou d’un adénovirus codant pour le BDNF augmente la neurogenèse dans le bulbe olfactif (Zigova et al., 1998 ; Benraiss et al., 2001). A l’inverse, la réduction de la signalisation du BDNF induite par une altération de sa sécrétion, suite à une mutation génique causant la modification de sa structure biochimique, diminue la survie des neuroblastes nouvellement générés ainsi que les capacités olfactives des animaux lors de tests comportementaux (Bath et al., 2008). Ceci suggère que le BDNF par ses fonctions sur la survie neuronale, contribuerait au maintien des fonctions sensorielles.

L’ensemble de ces données permet d’établir que de nombreux facteurs de croissance ré-gulent la neurogenèse adulte. Ces molécules, présentes localement dans la niche neurogène agissent sur les cellules de la SVZ en synergie avec d’autres signaux extracellulaires.

1.2.2.2 Régulation par les cytokines

Initialement identifiées dans le système immunitaire, les cytokines sont des protéines inter-venant dans différents processus physiologiques dont la régulation de la neurogenèse adulte. Le leukaemia inhibitory factor (LIF) et le ciliary neurotrophic factor (CNTF) appartiennent à cette famille de protéines. Ils exercent leurs effets via un récepteur qui est un hétérodimère formé de la protéine gp130 et d’une protéine spécifique pour chaque type de cytokine (LIFR, récepteur du LIF ; CNTFR, récepteur du CNTF). La protéine gp130, nécessaire à la signalisation pour l’en-semble des cytokines, est exprimée dans la SVZ de rongeur adulte (Ip et al., 1993). Certaines cytokines, le LIF notamment, contrôlent l’autorenouvellement des cellules souches embryon-naires (Burdon et al., 2002 ; Satoh et Yoshiba, 1997) et s’avèrent exercer des effets similaires sur les cellules souches adultes.

CNTF

Le CNTF est exprimé dans la SVZ chez le rongeur adulte (Yang et al., 2008a). L’injection intracérébroventriculaire de ce facteur augmente le nombre de cellules aux caractéristiques de cellules souches in vitro (Shimazaki et al., 2001 ; Bauer et Patterson, 2006) et induit in vivo la prolifération dans la SVZ (Emsley et Hagg, 2003a). De plus, le blocage de la signalisation du CNTF endogène par l’injection d’anticorps neutralisants réduit la neurogenèse au sein de la SVZ (Emsley et Hagg, 2003a ; Yang et al., 2008a), suggérant que le CNTF contribue de manière endogène à la régulation de la neurogenèse adulte.

Figure

Figure 1.1 – Localisation de la neurogenèse in vivo dans le cerveau de mammifères adultes.

Figure 1.1

– Localisation de la neurogenèse in vivo dans le cerveau de mammifères adultes. p.16
Figure 1.2 – Les caractéristiques cardinales des cellules souches de la zone sous- sous-ventriculaire (SVZ)

Figure 1.2

– Les caractéristiques cardinales des cellules souches de la zone sous- sous-ventriculaire (SVZ) p.18
Figure 1.3 – La migration des neuroblastes vers le bulbe olfactif. (A) Migration en chaîne.

Figure 1.3

– La migration des neuroblastes vers le bulbe olfactif. (A) Migration en chaîne. p.20
Figure 1.5 – Identité de la cellule souche de la SVZ. (A) Illustration de la régénération des cellules de la SVZ de souris adulte après traitement à l’Ara-C

Figure 1.5

– Identité de la cellule souche de la SVZ. (A) Illustration de la régénération des cellules de la SVZ de souris adulte après traitement à l’Ara-C p.24
Tableau 1.1 – Expression de différents marqueurs cellulaires dans la SVZ de la sou- sou-ris adulte

Tableau 1.1

– Expression de différents marqueurs cellulaires dans la SVZ de la sou- sou-ris adulte p.25
Figure 1.6 – Organisation de la zone sous-granulaire de mammifère adulte. Schéma d’une coupe frontale de cerveau faisant apparaître le gyrus denté (DG) de l’hippocampe et les  dif-férents types cellulaires : B : astrocytes ; D : cellules progénitrices ; G

Figure 1.6

– Organisation de la zone sous-granulaire de mammifère adulte. Schéma d’une coupe frontale de cerveau faisant apparaître le gyrus denté (DG) de l’hippocampe et les dif-férents types cellulaires : B : astrocytes ; D : cellules progénitrices ; G p.26
Figure 1.7 – Les cellules souches appartiendraient au lignage cellule du neuroépithélium

Figure 1.7

– Les cellules souches appartiendraient au lignage cellule du neuroépithélium p.28
Figure 1.8 – Schéma illustrant les connexions entre différentes voies de régulation des cel- cel-lules souches neurales

Figure 1.8

– Schéma illustrant les connexions entre différentes voies de régulation des cel- cel-lules souches neurales p.30
Figure 1.9 – Protocole de Weiss et ses collaborateurs (1996) permettant de tester la présence de cellules souches au sein d’une région cérébrale.

Figure 1.9

– Protocole de Weiss et ses collaborateurs (1996) permettant de tester la présence de cellules souches au sein d’une région cérébrale. p.45
Figure 1.10 – Organisation de la niche neurogène. (A) La niche est localisée près des vais- vais-seaux sanguins et les cellules souches neurales interagissent avec les neurones, les cellules endothéliales qui bordent les vaisseaux et les astrocytes

Figure 1.10

– Organisation de la niche neurogène. (A) La niche est localisée près des vais- vais-seaux sanguins et les cellules souches neurales interagissent avec les neurones, les cellules endothéliales qui bordent les vaisseaux et les astrocytes p.47
Figure 1.11 – Expression du HGF et de son récepteur c-Met au sein du cerveau de rongeur adulte

Figure 1.11

– Expression du HGF et de son récepteur c-Met au sein du cerveau de rongeur adulte p.53
Figure 2.1 – Schéma de culture de cellules souches de la SVZ. Les SVZ sont prélévées, dis- dis-sociées et les cellules mises en culture en présence d’EGF

Figure 2.1

– Schéma de culture de cellules souches de la SVZ. Les SVZ sont prélévées, dis- dis-sociées et les cellules mises en culture en présence d’EGF p.57
Figure 2.3 – Test des capacités à l’autorenouvellement des cellules de la SVZ. Les sphères primaires sont obtenues en présence d’EGF supplémenté d’un autre facteur e.g

Figure 2.3

– Test des capacités à l’autorenouvellement des cellules de la SVZ. Les sphères primaires sont obtenues en présence d’EGF supplémenté d’un autre facteur e.g p.63
Figure 3.3 – Le FGF-2 libéré par les explants de cortex apoptotique augmente la prolifé- prolifé-ration des cellules de la SVZ

Figure 3.3

– Le FGF-2 libéré par les explants de cortex apoptotique augmente la prolifé- prolifé-ration des cellules de la SVZ p.77
Figure 3.4 – Les facteurs libérés par le cortex apoptotique favorisent la différenciation neu- neu-ronale des précurseurs de la SVZ

Figure 3.4

– Les facteurs libérés par le cortex apoptotique favorisent la différenciation neu- neu-ronale des précurseurs de la SVZ p.79
Figure 4.1 – Illustration de neurosphères obtenues en présence de SFM seul (A) ou supplé- supplé-menté de milieu conditionné hépatique (B)

Figure 4.1

– Illustration de neurosphères obtenues en présence de SFM seul (A) ou supplé- supplé-menté de milieu conditionné hépatique (B) p.85
Figure 4.2 – Effet du milieu conditionné et du HGF sur la mort des cellules de la SVZ.

Figure 4.2

– Effet du milieu conditionné et du HGF sur la mort des cellules de la SVZ. p.86
Figure 4.3 – Caractérisation du facteur responsable de l’effet mitogène du milieu condi- condi-tionné hépatique

Figure 4.3

– Caractérisation du facteur responsable de l’effet mitogène du milieu condi- condi-tionné hépatique p.87
Figure 4.4 – Implication du HGF dans l’effet mitogène induit par le milieu conditionné hépatique sur les cellules de SVZ

Figure 4.4

– Implication du HGF dans l’effet mitogène induit par le milieu conditionné hépatique sur les cellules de SVZ p.88
Figure 4.5 – Les cellules de la SVZ expriment c-Met, le récepteur au HGF. Photographies de cellules de la SVZ incubées avec des anticorps dirigés contre c-Met (en vert) et divers  anti-gènes (en rouge) : nestine (A), LeX/SSEA1 (B), GFAP (C) ou doublecortin

Figure 4.5

– Les cellules de la SVZ expriment c-Met, le récepteur au HGF. Photographies de cellules de la SVZ incubées avec des anticorps dirigés contre c-Met (en vert) et divers anti-gènes (en rouge) : nestine (A), LeX/SSEA1 (B), GFAP (C) ou doublecortin p.91
Figure 4.6 – Le HGF augmente la population des cellules à caractéristiques de souches.

Figure 4.6

– Le HGF augmente la population des cellules à caractéristiques de souches. p.93
Figure 4.7 – Synthèse et effets cellulaires du HGF. Le HGF est libéré dans le milieu extracel- extracel-lulaire sous la forme d’un précurseur inactif, le pro-HGF, qui est ensuite activé par clivage en 2 chaînes reliées par un pont disulfure, au moyen de sé

Figure 4.7

– Synthèse et effets cellulaires du HGF. Le HGF est libéré dans le milieu extracel- extracel-lulaire sous la forme d’un précurseur inactif, le pro-HGF, qui est ensuite activé par clivage en 2 chaînes reliées par un pont disulfure, au moyen de sé p.94
Figure 4.8 – Voies de signalisation activées par le HGF dans les cellules de SVZ. Détec- Détec-tion par WB de c-Met phosphorylé (A et B) et des protéines ERK1/2 phosphorylées (C et D) en présence (5 et 15 minutes) ou non (0) de 20 ng.ml − 1 HGF

Figure 4.8

– Voies de signalisation activées par le HGF dans les cellules de SVZ. Détec- Détec-tion par WB de c-Met phosphorylé (A et B) et des protéines ERK1/2 phosphorylées (C et D) en présence (5 et 15 minutes) ou non (0) de 20 ng.ml − 1 HGF p.95
Figure 4.9 – Effet du blocage du récepteur c-Met sur la croissance des cultures de SVZ.

Figure 4.9

– Effet du blocage du récepteur c-Met sur la croissance des cultures de SVZ. p.96
Figure 4.10 – Les cellules de la SVZ produisent et libèrent du HGF. Illustrations de cellules de SVZ maintenues en absence (A) ou en présence (B) de brefeldine A et incubées en présence de TOPRO-3 (en bleu) et avec des anticorps dirigés contre le HGF (en v

Figure 4.10

– Les cellules de la SVZ produisent et libèrent du HGF. Illustrations de cellules de SVZ maintenues en absence (A) ou en présence (B) de brefeldine A et incubées en présence de TOPRO-3 (en bleu) et avec des anticorps dirigés contre le HGF (en v p.98
Figure 4.13 – Le HGF augmente la prolifération des cellules de la SVZ in vivo. Coupes co- co-ronales de cerveau de souris adultes incubées en présence d’anticorps dirigés contre le HGF (en vert, A-C) ou c-Met (en vert, D-F), et nestine (B et E) ou GFAP (C

Figure 4.13

– Le HGF augmente la prolifération des cellules de la SVZ in vivo. Coupes co- co-ronales de cerveau de souris adultes incubées en présence d’anticorps dirigés contre le HGF (en vert, A-C) ou c-Met (en vert, D-F), et nestine (B et E) ou GFAP (C p.102
Figure 4.14 – Caractérisation des cellules en prolifération dans la SVZ suite à une injection intracérébroventriculaire de HGF

Figure 4.14

– Caractérisation des cellules en prolifération dans la SVZ suite à une injection intracérébroventriculaire de HGF p.103
Figure 5.1 – Effet du milieu conditionné hépatique sur le phénotype des cellules obtenues en culture

Figure 5.1

– Effet du milieu conditionné hépatique sur le phénotype des cellules obtenues en culture p.108
Figure 5.2 – Caractérisation immunocytochimique des cellules de SVZ maintenues en pré- pré-sence de milieu conditionné hépatique

Figure 5.2

– Caractérisation immunocytochimique des cellules de SVZ maintenues en pré- pré-sence de milieu conditionné hépatique p.109
Figure 5.3 – Caractérisation du facteur impliqué dans la différenciation des cellules de SVZ maintenues en présence de milieu conditionné hépatique

Figure 5.3

– Caractérisation du facteur impliqué dans la différenciation des cellules de SVZ maintenues en présence de milieu conditionné hépatique p.111

References